Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало

ПЦР

Принцип способа полимеразной цепной реакции (ПЦР, Polymerase chain reaction, PCR) был разработан Кэри Мюллисом (компания "Cetus", США) в 1983 г. Открытие ПЦР стало одним из более выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало. За разработку ПЦР-анализа К.Мюллис в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии. Возникновение способа ПЦР было обосновано определенными достижениями молекулярной генетики, сначала расшифровкой нуклеотидной последовательности геномов ряда микробов Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало. Нельзя не сказать, что ПЦР стала вероятной благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у микробов, обитающих в гейзерах. Особенность этой полимеразы заключается в ее исключительной термостойкости (выдерживает нагревание до температуры кипения без Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало утраты активности) и высочайшей рабочей температуре (оптимум работы - 72оС).

Грациозность, простота выполнения, непревзойденные характеристики чувствительности и специфики принесли новенькому способу невиданную популярность. За куцее время ПЦР-анализ распространился по Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало всему миру, стремительно выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. Диагностика заразных болезней, в том числе вызванных агентами, тяжело поддающимися культивированию, генотипирование микробов, оценка их вирулентности, определение стойкости микрофлоры к лекарствам Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, генодиагностика и генетическая дактилоскопия, пренатальная диагностика, био контроль препаратов крови - вот далековато не полный список направлений медицины, где с фуррором применяется ПЦР.

В текущее время предложены различные модификации ПЦР, разрабатываются новые амплификационные технологии Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, основанные на клонировании, как ДНК, так и РНК-фрагментов. Из схожих способов, апробированных на клиническом материале, можно именовать лигазную цепную реакцию (ЛЦР, LCR), NASBA (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification), способ с Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало внедрением QB-репликазы и др. В последних 2-ух способах реакция осуществляется в изотермическом режиме, и для ее проведения не требуется амплификационного оборудования. Все же, на сегодня ПЦР-анализ остается более всераспространенной и оживленно Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало развивающейся технологией. Раз в год на рынке возникают 10-ки новых тест-систем для ПЦР-анализа, предназначенных как для выявления нуклеотидных последовательностей разных микробов - возбудителей болезней, так и для исследования генов Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало человека. Себестоимость ПЦР-анализа непреклонно понижается, что содействует все более широкому использованию способа в целительных и исследовательских учреждениях. Количество ПЦР-лабораторий в странах СНГ вырастает в геометрической прогрессии и, видимо, в последнее время Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало ПЦР-анализ станет одним из часто встречающихся способов лабораторной диагностики.

^ Принцип способа ПЦР

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) является универсальным носителем генетической инфы у всех имеющихся на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие мельчайшие организмы Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Любая нить состоит из соединенных поочередно нуклеотидов. Нити ДНК имеют обратную направленность: 5’-концу одной нити соответствует 3’-конец 2-ой нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность умножаться Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало. В живой клеточке этот процесс происходит последующим образом: при помощи особых ферментов - гираз происходит расплетение спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Дальше водородные связи, связывающие нити Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, разрываются и нити расползаются. Одна из цепей (“+” либо смысловая) употребляется в качестве основной матрицы. Построение новейшей нити ДНК идет исключительно в одном направлении - от 5’-конца к 3’-концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплиментарности Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтоб фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - маленького исходного двухцепочечного куска. Стартовый блок появляется при содействии маленького одноцепочечного куска ДНК, именуемого праймером, с комплиментарным участком Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало соответственной цепи родительской ДНК. Репликация сразу идет и на 2-ой нити ДНК (“-” либо антисмысловой), только наращивание цепи происходит в оборотном направлении. В итоге процесса репликации из одной молекулы ДНК появляется две Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало молекулы ДНК, в каких одна нить от материнской молекулы ДНК, а 2-ая, дочерняя, вновь синтезированная.

Таким макаром, цикл репликации ДНК содержит в себе три главные стадии:

1) расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало);

2) присоединение праймеров;

3) достраивание цепи дочерней нити.

В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в повторяющемся режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается конфигурацией температуры инкубационной консистенции. При нагревании раствора Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало до 93-95оС происходит денатурация ДНК. Для перехода к последующему шагу - присоединению либо “отжигу” праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65оС. Дальше смесь нагревают до 70-72оС - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новейшей Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало нити ДНК. Дальше цикл повторяется опять.

Так как наращивание дочерних нитей ДНК должно идти сразу на обеих цепях материнской ДНК, то для репликации 2-ой цепи также требуется собственный праймер. Таким Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало макаром, в обскурантистскую смесь вносятся два праймера: один для “+”-цепи, 2-ой для “-”-цепи. Присоединившись к обратным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в предстоящем неоднократно удвоен либо Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало амплифицирован. Длина такового куска, который именуется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным звеном в разработке диагностикума. Требуется подобрать таковой кусок молекулы ДНК, который бы отличался генетической Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало консервативностью и находился бы только у интересующего вида микробов либо в исследуемом гене. При всем этом длина такового куска должна составлять 15-30 нуклеотидов. Сделать эту работу помогают особые компьютерные программки, использующие информацию о нуклеотидной Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало последовательности узнаваемых микробов либо генов человека. Получить схожую информацию можно из интернациональных компьютерных банков данных (Gen bank, EMBL) через сеть Internet. Синтез праймера по данной последовательности нуклеотидов не представляет технической трудности и Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало осуществляется в автоматических синтезаторах.

Другие составляющие ПЦР: дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ) в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм; магний, нужный для работы taq-полимеразы (2-3 мМ); трис-HCl-буфер рН 6,8-7,8.

Каждый цикл Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало амплификации включает 3 шага, протекающие при разных температурных режимах.

1 шаг: денатурация ДНК. Протекает при 93-950 в течение 30-40 сек.

2 шаг: отжиг праймеров. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к подходящим последовательностям на обратных цепях ДНК на границах специфичного Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой размещаются в интервале 50-65оС. Время отжига 20-60 сек.

3 шаг: достраивание цепей ДНК. Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало цепи в обратных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в каком происходит образование специфичного куска ДНК - ампликона. В следующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало для синтеза новых цепей. Таким макаром, происходит скопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n - число циклов амплификации. Потому, даже если в начальном растворе сначало находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало 30-40 циклов в растворе скапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества довольно для достоверной зрительной детекции этого куска способом электрофореза в агарозном геле.

^ Достоинства способа ПЦР как способа диагностики заразных болезней

Многие Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало классические способы диагностики, к примеру иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности заразных агентов, что дает только опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфичного участка ДНК возбудителя способом ПЦР дает прямое указание Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало на присутствие возбудителя инфекции.

Высочайшая специфика способа ПЦР обоснована тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, соответствующий только для данного возбудителя кусок ДНК. Специфика задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало возможность получения неверных результатов, в отличие от иммунологических способов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

Способ ПЦР позволяет выявлять даже единичные клеточки микробов либо Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей заразных болезней в тех случаях, когда другими способами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопичными) это сделать нереально. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопичных тестов Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало - 103-105 клеток).

Материалом для исследования способом ПЦР служит ДНК возбудителя. Способ основан на выявлении куска ДНК либо РНК, являющегося специфическим для определенного организма. Сходство хим состава всех нуклеиновых кислот позволяет Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало использовать унифицированные способы проведения лабораторных исследовательских работ. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут употребляться разные био выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, кровь, сыворотка.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выкармливание культуры возбудителя, что занимает огромное количество времени. Унифицированный способ обработки биоматериала и детекции товаров реакции и автоматизация Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов.

В особенности эффективен способ ПЦР для диагностики тяжело культивируемых, некультивируемых Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало и персистирующих форм микробов, с которыми нередко приходится сталкиваться при латентных и приобретенных инфекциях, так как этот способ дает возможность избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микробов в лабораторных критериях. Применение ПЦР-диагностики Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало также очень отлично в отношении возбудителей с высочайшей антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Необходимо подчеркнуть, что способом ПЦР может быть выявление возбудителей не только лишь в клиническом материале, приобретенном от хворого, да и в Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало материале, получаемом из объектов наружной среды (вода, почва и т.д.).

^ Ограничения способа ПЦР

Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало исцеления. В общем случае схожий контроль должен проводиться спустя просвет времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Обычно этот интервал составляет 4-8 недель.

Подбор праймеров происходит на базе имеющихся Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало познаний о геноме данного и схожих микробов. На теоретическом уровне существует возможность присутствия того же куска и у других микробов, геном которых в текущее время не расшифрован, и которые не были протестированы Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микробов может привести к ложноположительному результату анализа.

Изменчивость микробов

Хотя при конструировании тест-системы кусок генома, применяемый для амплификации, выбирается из Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало высоко ограниченной области, изменчивость микробов может приводить к тому, что некие генотипы либо штаммы исследуемого возбудителя могут получать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким макаром, становиться неуловимыми данной тест-системой.

^ Проведение полимеразной Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало цепной реакции

Определенное количество эталона из обработанной медицинской пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 0,2 либо 0,5 мл. В эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера, раствора Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало дНТФ, раствора праймеров и раствора Taq-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Обычно, объем обскурантистской консистенции составляет 25 мкл. Потом в каждую пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения обскурантистской консистенции в Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало процессе амплификации. Пробирки переносятся в программируемый термостат (амплификатор) и проводится амплификация в автоматическом режиме по данной программке, соответственной виду определяемой инфекции. Время проведения реакции зависимо от данной программки составляет 2-3 часа. Наряду Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало с опытнейшеми пробами ставятся контрольные: положительный контроль содержит в себе все составляющие реакции, но заместо материала клинического эталона вносится контрольный продукт ДНК исследуемого возбудителя. Отрицательный контроль содержит в себе все составляющие реакции Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, но заместо клинического материала либо продукта ДНК вносится соответственное количество деионизованной воды либо экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль нужен для проверки компонент реакции на отсутствие в их ДНК либо клеток возбудителя вследствие Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало контаминации и исключить учет ложноположительных результатов.

^ Применение ПЦР в практическом здравоохранении

Внедрение способа ПЦР для диагностики заразных болезней как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих заморочек Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало микробиологии и эпидемиологии. Применение этого способа также содействует развитию базовых исследовательских работ в области исследования приобретенных и практически неизученных заразных болезней. Но необходимо подчеркнуть, что способ ПЦР только дополняет диапазон обычных способов, применяемых Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало в микробиологической диагностике. Более правильно и отлично применение ПЦР для обнаружения микробов тяжело культивируемых в лабораторных критериях, атипичных форм микробов. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и мельчайшие организмы, способные продолжительно Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало персистировать в организме владельца. В таблице 2 приведены главные показания к применению способа ПЦР при разных заболеваниях.

Таблица 2. Применение ПЦР в медицинской практике

^ Показания к проведению ПЦР-исследования

Материал для исследования

Возбудитель

Примечание

Цервицит, эндометрит

Цервикальный соскоб, аспират Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало из полости матки

Сhlamydia trachomatis,

Mycoplasma hominis,

Mycoplasma genitalium,

Ureaplasma urealiticum,

Neisseria gonorrhoeae,

Trichomonas vaginalis,

Gardnerella vaginalis,

Candida albicans

Вирус обычного герпеса I, II типов

Может быть проведение типирования U.urealiticum (Parvo и T960), определение устойчивосости микрофлоры Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало к лекарствам тетрациклинового ряда и макролидам

Сальпингит, периаппендицит

Цервикальный соскоб, биоптаты, приобретенные при лапароскопии

Бактериальный вагиноз, вагинит, вульвовагинит у девченок

Эпителиальный соскоб из влагалища

Уретрит, простатит

Соскоб из уретры, моча, сок простаты

Эпидидимит

Сперма

Проктит

Соскоб из прямой кишки

Бесплодие, невынашивание беременности Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, эктопическая беременность

Цервикальный соскоб,

Синдром Рейтера

Эпителиальный соскоб из уретры и конъюнктивы

Герпетические поражения гениталий, слизистых оболочек, кожных покровов и др.

Эпителиальный соскоб с пораженного участка, кровь

Вирус обычного герпеса I, II, VI типов, вирус Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало Эпштейн-Барра, вирус Варицелла Зостер




Кандиломатоз

Эпителиальный соскоб с пораженного участка

Папилломовирус (HPV)

Вероятна идентификация онкогенных (6, 11, 16, 18) типов вируса

Пневмония новорожденных, рецидивирующие приобретенные заболевания верхних отделов дыхательной системы

Эпителиальный соскоб с задней стены глотки, бронхоальвеолярный лаваж Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, мокрота

Сhlamydia trachomatis,

Сhlamydia pneumoniae,

Mycoplasma pneumoniae,

Mycoplasma hominis,

Mycobacterium tuberculosis

 

Конъюнктивит (в том числе у новорожденных)

Эпителиальный соскоб из конъюнктивы

Сhlamydia trachomatis,

Neisseria gonorrhoeae,

Вирус обычного герпеса

 

Цитомегаловирусная зараза (в том числе внутриутробная и у Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало новорожденных)

Кровь, моча, слюна, амниотическая жидкость, биоптаты

Цитомегаловирус (CMV)

 

Туберкулез легких

Мокрота, бронхоальвеолярный лаваж,

Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium bovis

Может быть определение стойкости микобактерий к лекарствам

Туберкулез мочеполовых и др. органов

Моча, соскоб с пораженного участка

Язва желудка, гастрит, дуоденит Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало

Биоптат слизистой

Helicobacter pylori




Вирусный гепатит

Кровь, биоптаты печени

Вирусы гепатитов В, С, D, G

Может быть генотипирование HBV, HCV.

Контроль крови и препаратов из нее в трансфузиологии и трансплантологии

Кровь

Вирусы гепатитов В, С, D, G, ВИЧ, герпеса Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, ЦМВ

 

ИФА      

В базе иммуноферментного анализа (ИФА) лежит иммунная реакция антигена с антителом. Посреди разных модификаций ИФА наибольшее распространение получили конкурентноспособный способ, используемый обычно в анализе гормонов, и способ двойного связывания, обычно Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало применяемый в серодиагностике зараз.  

В способе двойного связывания  1-ая реакция происходит меж определяемым Ig и очищенным антигеном возбудителя, фиксированным к поверхности лунок иммунологического планшета. После окончания первой реакции планшет отмывается. При всем Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало этом несвязавшиеся составляющие исследуемой пробы удаляются, а на стенах лунок остается комплекс антиген-антитело. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую иммунологичесую реакцию, в какой в качестве антигена выступает связавшийся Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало специфичный Ig, а в качестве антител к нему — коньюгат, представляющий из себя Ig (к примеру, кроличий) к соответственному Ig человека, меченный ферментом (обычно пероксидазой). После окончания 2-ой иммунологической реакции следует отмывка лунок планшета от излишка Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало коньюгата и дальше – 3-ий шаг – ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулы коньюгата. Субстратом данной реакции служит тусклое вещество – хромоген (орто-фенилендиамин, ОФД либо тетраметилбензидин, ТМБ), который в процессе реакции образует окрашенное вещество Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало. Интенсивность расцветки в лунке спецефическим образом находится в зависимости от количества содержащихся в пробе Ig. После остановки ферментативной реакции проводят фотометрирование лунок. Дальше с учетом значений оптической плотности контрольных проб проводят математическую Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало обработку результатов анализа. В общем случае, чем выше оптическая плотность в данной лунке, тем большее количество специфичных антител содержалось в соответственной пробе и, как следует, выше титр анализируемой сыворотки. При отсутствии Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало в сыворотке исследуемых антител лунки остаются неокрашенными.

В конкурентноспособном анализе антитела к определяемому соединению фиксированы к поверхности лунки планшета. В лунки вносится анализируемая проба и коньюгат, конкурирующий за места связывания с фиксированными Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало антителами и имеющий в собственном составе ферментативную метку. Анализ проводится в два шага: иммунологическая реакция и ферментативня реакция. Зависимость меж концентрацией анализируемого вещества и оптической плотностью в лунках имеет оборотную Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало зависимость

Для исследования способом ИФА употребляется кровь из локтевой вены, приобретенная натощак.

К плюсам ИФА можно отнести высочайшие чувствительность, специфика, воспроизводимость, унифицированность и пригодность для массовых обследований. Возможность инструментальной оценки результатов избавляет фактор субъективности.

        Иммуно Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало-ферментный анализ (ИФА) применяется в диагностике урогенитальных зараз для выявления наличия в сыворотке крови специфичных иммуноглобулинов (Ig либо антител) - белков, вырабатываемых клеточками иммунной системы, направленных на борьбу с внедрившимся в организм заразным агентом Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало. Связываясь с микробной клеточкой либо продуктами ее жизнедеятельности, иммуноглобулины нейтрализуют их и содействуют их элиминации. Таким макаром, иммуноглобулины представляют собой сущность гуморального иммунитета, другими словами иммунитета, обусловленного веществами, содержащимися в жидкостях тела Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, в отличие от клеточного иммунитета, связанного с присутствием особых клеток иммунной системы. На каждый вид (и даже подвид) возбудителя вырабатываются свои определенные антитела, которые, обычно, не связываются ни с каким Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало другим заразным агентом. Благодаря этому определение антимикробных антител обеспечивает довольно высшую специфика анализа. Из 5 классов Ig в диагностике заразных болезней в большинстве случаев употребляются Ig 3-х типов А, M и G. В нашей Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало лаборатории делается определение IgM и IgG. Выработка иммуноглобулинов происходит по определенным законам, которые следует знать для правильной интерпретации получаемых результатов.

Сначала необходимо держать в голове, что существует некий просвет времени Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало с момента внедрения заразного агента в организм и до момента возникновения антител в сыворотке крови - это так именуемый серонегативный период. Для разных зараз и отдельных индивидуумов он может быть неодинаков, в среднем же для Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало возбудителей урогенитальных болезней он составляет 1-4 недели. Динамика содержания Ig в сыворотке крови по мере течения инфекции приведена на рис.1.



Из рисунка видно, что сначала начинают вырабатываться IgM, пик которых приходится на Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало максимум проявлений клинических признаков острой инфекции. Потому IgM принято считать маркером острой фазы заболевания. С отставанием на 1-2 недели начинает возрастать титр IgG. В следующем содержание IgM в сыворотке крови понижается, а IgG - продолжает Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало возрастать. Этот период соответствует стадии перехода инфекции из острой фазы в приобретенную. Если в некий момент происходит обострение приобретенной инфекции, то наблюдается новый всплеск IgM с следующим повышением титра IgG Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, соответственном фазе ремиссии. Если организм совладевает с заразой (сам либо при помощи медикаментов), то IgG могут еще долгое время (а для неких зараз и на всю жизнь) оставаться завышенными. Для ряда болезней, таких как Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало корь, дифтерия, паротит и другие, наличие специфичных иммуноглобулинов является надежным барьером против повторного инфицирования. К огорчению, это не относится к урогенитальным болезням (хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз и др.), иммунитет против которых не развивается. Обычно Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало спустя 2 месяца после действенной терапии уровень IgG опускается ниже критичного значения, все же следует с осторожностью использовать данные анализа IgG в качестве показателя излеченности, так как, в силу личных особенностей иммунной Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало системы, данные антитела еще долгое время (3 и поболее месяцев) могут находиться в крови.

Как и хоть какой лабораторный способ диагностики ИФА имеет свои плюсы и недочеты. К преимуществам способа можно отнести его возможность Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало по анализу крови выявлять наличие инфекции хоть какой локализации, также возможность смотреть в динамике по уровню титра за ходом заболевания. К недочетам способа сначала относится то, что он является непрямым, другими словами Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало определяется не возбудитель, а иммунный ответ на него, который может иметь личные варианты.

По оценкам ряда создателей чувствительность и специфика способа ИФА составляет соответственно 90% и 95% соответственно, что является достаточно высочайшим Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало показателем для лабораторного способа. Естественно, что только по наличию тех либо других антител не может быть поставлен достоверный диагноз заболевания. Нужным и почти всегда достаточным для постановки достоверного диагноза можно считать Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало одновременное выявление антител к возбудителю способом ИФА и прямое выявление возбудителя способом ПЦР либо ПИФ.

^ Электрофорез на полиакриламидном геле (ПААГ,PAGE)

Сущность метода- разделение заряженных соединений на базе их подвижности в электрофоретическом поле. При наложении Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало разности потенциалов в некий среде положительно заряженные молекулы движутся к негативно заряженному электроду, а негативно заряженные- к положительному электроду. В качестве среды разделения употребляется гель полиакриламида в воде. Если в Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало жаркой воде растворить определенное количество полиакриламида и потом раствор охладить появляется студень, именуемый гелем. Природа хоть какого геля- структура, в какой молекулы воды удерживаются снутри трехмерной сетки, образованной длинноватыми полимерными молекулами. С повышением концентрации Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало молекул полимера в геле "ячейки" этой сетки становятся все мельче, а с уменьшением- напротив, поперечник "ячейки" возрастает. В базу разделения молекул белков гель-электрофорезом положены эти главные свойства геля.

Более Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало нередко разделение осуществляется на пластинках, покрытых слоем геля шириной 2-3 мм. Размеры пластинки 10 х 14 см либо другое, зависимо от конструкции прибора. В процессе электрофореза пластинка с гелем разогревается в итоге протекания через нее Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало тока. Степень разогрева пластинки находится в зависимости от величины напряжения, при котором происходит разделение. Чем выше напряжение, тем выше сила протекающего по пластинке тока и посильнее ее разогревание, потому применение больших напряжений должно Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало сопровождаться остыванием пластинки, чтоб не допускать термическую денатурацию разделяемых белков. Величина продвижения белков в геле зависит (в эталоне) только от величины наложенного потенциала и времени. В среднем, основная масса разделений просит Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало около 2000 В.часов. Это значит, что при потенциале 500 В разделение может окончиться за 4 часа, а при потенциале 150 В на это будет нужно около 14 часов.

Аппаратура для гель-электрофореза может различаться конструктивно при Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало неизменности принципов разделения.

Есть две главные разновидности электрофореза –на градиентных гелях и с ионным деретгентом ^ (ДСН-ПААГ, SDS-PAGE).


Электрофорез на градиентном полиакриламидном геле.

В качестве среды разделения употребляется пластинка с Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало гелем с изменяющейся концентрацией (от 4 до 30 %) полиакриламида. В большинстве случаев употребляются ТРИС-боратные буферы (рН=8,4) с добавками динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Гель уравновешивается с буфером наложением потенциала 70 В в течение 20 мин (без прибавления эталона Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало). После чего наносятся полосы анализируемых образцов и маркеров (белков с известной ММ) и накладывается потенциал 150 В, разделение длится 16 часов. (Либо 3 часа при 500 В- если имеется возможность остывания пластинки).

Фиксирование полос происходит 30 мин Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало в 10 % растворе сульфосалициловой кислоты, после этого пластинка окрашивается красителем Кумасси Голубой (0,02% в 7% уксусной кислоте) в течение ночи. Пластинка осветляется электрофорезом при 24 В 45 мин в 7% уксусной кислоте, после этого можно следить окрашенные полосы Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало белков.

Разделение осуществляется в итоге задерживания (застревания) белковых молекул во все более мелкопористом (рост содержания полиакриламида) геле. При всем этом происходит скопление белка, за счет постепенного «подтягивания» отстающих молекул. Способ Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало отличается высочайшей эффективностью разделения и очень узенькими полосами разделения. Количество наносимой пробы находится в зависимости от метода окрашивания белка, с красителем Кумасси составляет 5 мкл. (С серебряным прокрашиванием- концентрация белка может быть Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало в 50 раз меньше).

Калибровочный график для определения молекулярных масс неведомых белков представляет собой зависимость:


^ Электрофорез SDS-PAGE (с додецилсульфонатом натрия).

Более всераспространенным в ближайшее время является вариант электрофореза в присутствии детергентов, в частности- додецилсульфоната натрия Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало (SDS). Процесс можно производить как на геле неизменной плотности, так и на градиентных гелях. В базе способа лежит способность детергента реагировать и денатурировать широкий диапазон белков схожим образом. Нативные белки Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало, имеющие разные форму молекулы, заряд и размеры в процессе взаимодействия с SDS преобразуются в комплексы с ним, имеющие неизменное соотношение заряда на единицу массы (потому что заряд SDS маскирует заряды протеинов) и Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало идентичную конформацию, которая варьирует в размере прямо пропорционально молекулярной массе субъединицы. При постоянных критериях электрофореза (рН, напряжение, время, концентрация геля и т.д.) электрофоретическая подвижность протеина находится в зависимости от его плотности заряда, массы Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало и формы. Так как большая часть комплексов протеин-SDS имеют неизменные соотношения "заряд-масса" и идентичную форму, их подвижность зависит только от размера. Потому определение молекулярной массы неведомого протеина Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало сводится к сопоставлению подвижности его комплекса с SDS с подвижностью комплексов "SDS-протеин известной молекулярной массы". Обработка образцов осуществляется добавлением SDS до концентрации 2,5% и бетта-меркаптоэтанола до концентрации 5%, после этого смесь кропотливо перемешивается Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало и греется при 100 С (в кипящей водяной бане) в течение 5-10 минут. Таким макаром достигается полная денатурация и диссоциация четвертичной структуры.

Электрофоретическая картина разделения протеинов на геле неизменной концентрации (12,6%) в присутствии детергента (0,1% SDS) смотрится так Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало:

И ее калибровочная зависимость:



То же разделение, на градиентном геле Pharmacia PAA 4/30 в 0,2% SDS:

и его графическая зависимость для определения молекулярной массы:


Калибровочные (по молекулярной массе) белки:

Высокомолекулярные белки (HMW):

Белок

ММ Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало нативного

ММ субъединиц

Источник

Тироглобулин

669,000

330,000

свинья

Ферритин

440,000

18,500 (220,000)

селезенка лошадки

Каталаза

232,000

60,000

говяжья печень

Лактат-дегидрогеназа

140,000

36,000

говяжье сердечко

Альбумин

67,000

67,000

сыворотка быка

Низкомолекулярные белки (LMW):

Белок

ММ субъединицы

Источник

Фосфорилаза В

94,000

мускула зайчика

Альбумин

67,000

сыворотока быка

Овальбумин

43,000

яичный белок

Карбоангидраза

30,000

эритроциты быка

Ингибитор трипсина

20,100

соевые бобы

альфа-Лактальбумин

14,400

коровье молоко

При анализах с SDS может быть частичное разрушение белков четвертичной структуры, которое достигается более Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало мягенькими критериями денатурации (1% SDS и 1% бетта-меркаптоэтанола, нагревание при 60 С в течение 15 мин). В таких критериях можно найти сразу полуединицу ферритина (ММ 220,000) и субъединицу (ММ 18,500). Без денатурации нативный ферритин Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало имеет массу 440,000 Да.

Иммуноблотинг

После разделения сложной консистенции белков способом электрофореза в полиакриламидном либо ага- розном геле их можно перенести из геля на микропористую нитроцеллюлозную мембрану.

Рис. Схема иммуноблотинга

Дальше неспецифически связанные с Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало мембраной антигены могут быть идентифицированы при помощи меченых антител. Данный способ получил обширное распространение. К примеру, он употребляется для идентификации компонент нейрофиламентов, которые за ранее делят в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало (ДСН).




Рис. Пример иммуноблотинга

Очевидно, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методика употребляться не может. Если белки антисывороткк поделить изоэлектрофокусированием, а потом перенести (это и именуется блоттингом) на мембрану, то при помощи Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало меченого антигена можно установить и так именуемый спектротип антисыворотки, т.е. найти изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

Схема: Главные способы расцветки в иммуноблотинге (Western-blot).


Гель с исследуемым прототипом после электрофореза


Перенос разбитых Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало белков на мембрану

^ Определение белков

Определение антигена

Аннионые красители

Биотиновые плашки для блоттинга

Красители из коллоидного золота

Амидо темный либо кумаси голубий (R-250)

4- хлоро - 1 -нафтол (4CN)

Усиление расцветки

Блок неспецифических мест связывания

Инкубация со специфичными антителами

Инкубация с реагентом

Коньюгаты Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало пероксидазы хрена

Коньюгаты золота

Коньюгаты щелочной фосфатазы

Коньюгаты биотина, стрептовидин

4хлоро-1-нафтол, 3,3’-диамино- бензидин (DAB)

Усиление

расцветки

Хемилюминесцентное определение


5-бромо-4-хлоро-3-индол фосфат (BCIP),

нитросиний тетразоль (NBT)



Источники:

1. http://www.lab.elcat.kg/ifa.htm

2. http://www.medicus Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало.ru/wellness/pats/?cont=article&art_id=2310

3. http://orgchem2.city.tomsk.net/forez/page.htm

4. http://www.5ka.ru/50/11241/1.html


^ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО Проф ОБРАЗОВАНИЯ

НОВГОРОДСКИЙ Муниципальный Институт им. ЯРОСЛАВА Мудрейшего


институт мед Принцип метода полимеразной цепной реакции (пцр, Polymerase chain reaction, pcr) был разработан Кэри Мюллисом (фирма "Cetus", сша) в 1983 г. Открытие пцр стало образования

_____________________________________________________________________________________


Кафедра микробиологии и иммунологии


Доклад

на тему:

«Биотехнология. Диагностикумы: ИФА,ПЦР, элекрофорез на полиакриламидном геле, иммуноблотинг»


Выполнил:

студент , гр1452

Шиман В.А.

Проверил:

педагог

Шитяков С.В.

Величавый Новгород
2005

principi-formirovaniya-zvukovoj-storoni-rechi-u-detej-s-ffn.html
principi-funkcionirovaniya-distancionnogo-obucheniya.html
principi-funkcionirovaniya-sovershennoj-konkurencii.html